一、耐熱大腸菌群情況簡要介紹

  耐熱大腸菌群的定義：用提高培養(yǎng)溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區(qū)分開，在44.5℃仍能生長的大腸菌群，稱為耐熱大腸菌群。

  通常情況下，耐熱大腸菌群與大腸菌群相比，在人和動物糞便中所占的比例較大，而且由于在自然界容易死亡等原因，耐熱大腸菌群的存在可認為食品直接或間接的受到了比較近期的糞便污染。因而，耐熱大腸菌群在食品中的檢出，與大腸菌群相比，說明食品受到了更為不清潔的加工，腸道致病菌和食物中毒菌的可能性更大。

二、參考標準

  《GBT5750.12-2006生活飲用水標準檢驗方法微生物指標：耐熱大腸菌群》 點擊下載

三、檢驗方法以及結(jié)果分析

  3.1多管發(fā)酵法

  根據(jù)耐熱大腸菌群具有的生物特性，在44.5℃培養(yǎng)24 h能發(fā)酵乳糖并產(chǎn)氣的特點，將不同量的水樣接種到含乳糖的培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后根據(jù)陽性反應(yīng)結(jié)果可測出原水樣中耐熱大腸菌群的最可能數(shù)（MPN）。

  3.1.1 檢驗步驟

  3.1.1.1 乳糖發(fā)酵試驗

  （1）取10mL水樣接種到10mL雙料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，取1mL水樣接種到10mL單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，另取1mL水樣注入到9mL滅菌生理鹽水中，混勻后吸取1mL（即0.1mL水樣）注入到10mL單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，每一稀釋度接種5管。

  對已處理過的出廠自來水，需經(jīng)常檢驗或每天檢驗一次的，可直接種5份10mL水樣雙料培養(yǎng)基，每份接種10mL水樣。

  檢驗水源水時，如污染較嚴重，應(yīng)加大稀釋度，可接種1、0.1、0.01mL甚至0.1、0.01、0.001mL，每個稀釋度接種5管，每個水樣共接種15管。接種1mL以下水樣時，必須作10倍遞增稀釋后，取1mL接種，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌刻度吸管。

  （2）將接種管置36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24 h±2 h。

圖1 耐熱大腸菌群在乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中生長特征

  （3）從陽性管（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）中取1滴轉(zhuǎn)種于EC培養(yǎng)基中，置44.5℃水浴箱或隔水式恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)（水浴箱的水面應(yīng)高于試管中培養(yǎng)基液面），培養(yǎng)24h±2h，如所有管均不產(chǎn)氣，則可報告為陰性。

圖2 耐熱大腸菌群在EC培養(yǎng)基中生長特征

  如有產(chǎn)氣者，則轉(zhuǎn)種于伊紅美藍瓊脂平板上，置44.5℃培養(yǎng)18 h～24 h觀察菌落形態(tài)。凡平板上有以下典型菌落者，則證實為耐熱大腸菌群陽性：

  深紫黑色、具有金屬光澤的菌落；

  紫黑色、不帶或略帶金屬光澤的菌落；

  淡紫紅色、中心較深的菌落。

圖3 耐熱大腸菌群在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基中生長特征

  （4）如檢測未經(jīng)氯化消毒的水，且只想檢測耐熱大腸菌群時，或調(diào)查水源水的耐熱大腸菌群污染時，可用直接多管耐熱大腸菌群方法，即在第一步乳糖發(fā)酵試驗時按照步驟（1）接種乳糖蛋白胨培養(yǎng)液在44.5℃±0.5℃水浴中培養(yǎng)，以下步驟同步驟（3）。

  3.1.2 結(jié)果報告

  根據(jù)證實為耐熱大腸菌群的陽性管數(shù)，查本標準中總大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表，報告每100 mL水樣中耐熱大腸菌群的最可能數(shù)（MPN）值。

表1 耐熱大腸菌群（MPN）檢索表（部分）

（總接種量55.5mL，其中5份10mL水樣、5份1mL水樣、5份0.1mL水樣）

  3.2濾膜法

  耐熱大腸菌群濾膜法是指用孔徑為0.45μm的濾膜過濾水樣，細菌被阻留在膜上，將濾膜貼在加乳糖的選擇性培養(yǎng)基上，44.5℃培養(yǎng)24h能形成特征性菌落以此來檢測水中耐熱大腸菌群的方法。

  3.2.1 檢驗步驟

  （1）準備工作

  濾膜滅菌：將濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，置于沸水浴中煮沸滅菌3次，每次15min。前兩次煮沸后需更換水洗滌2次～3次，以除去殘留溶劑。

  濾器滅菌：用點燃的酒精棉球火焰滅菌。也可用蒸汽滅菌器103.43kPa（121℃）高壓滅菌20min。

  （2）過濾水樣

  用無菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙面向上，貼放在已滅菌的濾床上，固定好濾器，將100mL水樣（如水樣含菌數(shù)較多，可減少過濾水樣量，或?qū)⑺畼酉♂專┳⑷霝V器中，打開濾器閥門，在-5.07×10⁴Pa（負0.5大氣壓）下抽濾。

  （3）培養(yǎng)

  水樣濾完后，再抽氣約5s，關(guān)上濾器閥門，取下濾器，用滅菌鑷子夾取濾膜邊緣部分，移放在MFC培養(yǎng)基上，濾膜截留細菌面向上，濾膜應(yīng)與培養(yǎng)基wan全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后將平皿倒置，放入37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h±2h。如使用恒溫水浴，則需用塑料平皿，將皿蓋緊，或用防水膠帶貼封每個平皿，將培養(yǎng)皿成疊封入塑料袋內(nèi)，浸到44.5℃恒溫水浴里，培養(yǎng)24h±2h。耐熱大腸菌群在此培養(yǎng)基上菌落為藍色，非耐熱大腸菌群菌落為灰色至奶油色。

圖4 耐熱大腸菌群在MFC培養(yǎng)基上的菌落特征

  （4）對可疑菌落轉(zhuǎn)種EC培養(yǎng)基，44.5℃培養(yǎng)24h±2h，如產(chǎn)氣則證實為耐熱大腸菌群。

  3.2.2 結(jié)果報告

  計數(shù)被證實的耐熱大腸菌落數(shù)，水中耐熱大腸菌群數(shù)系以100mL水樣中耐熱大腸菌群菌落形成單位（CFU）表示，見下列公式：

  耐熱大腸菌菌落數(shù)（CFU/100mL）=所計得的耐熱大腸菌菌落數(shù)×100過濾水樣體積 

注:本文屬海博生物原創(chuàng),未經(jīng)允許不得轉(zhuǎn)載。